细胞红蛋白（ｃｙｔｏｇｌｏｂｉｎ）是由１９０个氨基酸组成的２１－ｋＤａ蛋白。它的三级结构具有经典的珠蛋白８个螺旋（Ａ至Ｈ），这８个螺旋折叠成三明治结构。与肌红蛋白、血红蛋白不同，细胞红蛋白是一个六配位蛋白。哺乳类动物的细胞红蛋白广泛分布于肝脏，心脏，脑，肺，视网膜，食管，肠等各个器官。在大部分器官中，它分布在纤维母细胞及间充质细胞的细胞质，而在脑神经元中，它在细胞质及细胞核中均有分布，提示着它在脑中具有某种特殊的生理功能。自２００１年发现细胞红蛋白以来，越来越多的研究结果表明它在缺氧应激状态时时扮演着保护组织、细胞的重要角色。神经细胞是大脑的基本功能单位，承载着大脑的感觉，运动，记忆，思维等各种生理功能。临床上治疗ＨＩＥ时，我们最关心的是神经元的存亡，这和病人的预后有很大的关联。但迄今为止，关于细胞红蛋白在体外培养的原代神经元缺氧时表达的研究尚无。本实验通过Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲ及Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ监测细胞红蛋白在原代神经元在缺氧时的表达，为研究细胞红蛋白在缺氧应激神经细胞中的调节通路提供实验基础，从而进一步为缺氧缺血性脑病中的治疗奠定基础。
１材料和方法
１．１实验动物、主要试剂与仪器孕１８ｄ的ＳＤ大鼠，由汕头大学医学院实验动物中心提供。Ｌ－ＧＬＵ－ＴＡＭＩＮＥ（ＧＩＢＣＯ），ＤＭＥＭ／Ｆ１２培养基（ＧＩＢＣＯ），Ｂ２７神经营养因子（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ），ＴＲＹＰＳＩＮ＋０．２５％ ＥＤＴＡ（ＧＩＢＣＯ），ＮＥＵＲＯＢＡＳＡＬ（ＧＩＢ－ＣＯ），多聚－Ｄ－赖氨酸 （ＳＩＧＭＡ），ＲＥＡＬＴＩＭＥ－ＰＣＲ试剂盒（大连宝生物工程有限公司），即用型免疫组化试剂盒（福州迈新），烯醇化酶一抗（福州迈新）及兔抗鼠二抗（福州迈新），β－ａｃｔｉｎ一抗（武汉博士德），胞红蛋白一抗（ＳＡＮＴＡ），羊抗兔二抗（博奥森），倒置相差显微镜（日本Ｏ－ＬＹＭＰＵＳ公司），ＣＯ２培养箱（苏州净化设备），荧光定量ＰＣＲ仪（ＬＩＦＥ），全能显微镜（ＬＥＩＣＡ），测氧仪（上海华光），酶标仪（Ｂｉｏ－ｒａｄ）。
１．２方法
１．２．１细胞的培养冰上取孕１８ｄ的胎鼠大脑皮层，用０．０６２５％消化后，加用含１０％胎牛血清的ＤＭＥＭ／Ｆ１２培养基吹打成悬液，用台盼蓝染色进行细胞计数，以２５万／ｃｍ２种植于预先用多聚赖氨酸包被的六孔板（ＰＣＲ及免疫印迹试验用）及９６孔板内（ｃｃｋ８用），置于３７℃，５％ＣＯ２的培养箱中进行培养，４ｈ细胞贴壁后换ＮＥＵＲＯＢＡＳＡＬ ＋２％Ｂ２７＋Ｌ－ＧＬＵＴＡＭＩＮＥ继续培养，每４８ｈ换液１次，培养至第６天用神经元特异性烯醇化酶（ＮＳＥ）免疫组织化学方法神经细胞进行纯度鉴定。
１．２．２神经元纯度鉴定吸净培养基，用２％多聚甲醛固定，甲醇双氧水浸泡，加山羊血清封闭，加一抗（对照组用ｐｂｓ代替），置４°冰箱过夜。第２天ＰＢＳ浸洗后，加二抗３０ｍｉｎ，加辣根过氧化物酶６０ｍｉｎ，ＰＢＳ浸洗后，滴加ＤＡＢ显色约５ｍｉｎ（显微镜下观察显色情况），ＰＢＳ冲洗，晾干，树胶封片。显微镜下随机选取１０个视野计数。
１．２．３细胞缺氧。实验前将培养基５％ＣＯ２和９５％Ｎ２的气体中过夜。实验时，将细胞随机分为４组，其中１组作为正常组（０ｈ），其余３组培养基换为预缺氧的培养基，然后充入５％ＣＯ２和９５％Ｎ２的气体的真空袋中，分别缺氧８ｈ，１６ｈ，２４ｈ，缺氧后用测氧仪监测气体的氧浓度，氧气浓度在０～０．９％之间的进行下一步实验。
１．２．４荧光定量。ＰＣＲ用Ｔｒｉｚｏｌ（Ｔａｋａｒａ）、氯仿、异丙醇、７５％乙醇裂解细胞分离沉淀ｍＲＮＡ，适当的ＤＥＰＣ水 溶 解ｍＲＮＡ，紫 外 分 光 光 度 计 测 定ＲＮＡ浓度和ＯＤ值（１．８～２．１），在逆转录酶作用下，将ｍＲＮＡ逆转录成ｃＤＮＡ。采用荧光染色技术进行实时定量多聚酶链反应（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅ－ａｃｔｉｏｎ，ＰＣＲ），获取各组标本标准曲线，计算机分析Ｃｔ值。７３００系 统 的ＰＣＲ的 反 应 条 件：第 一 阶 段９５℃３０ｓ；第二阶段９５℃３ｓ，６０℃３１ｓ，４０个循环；第三阶段９５℃ １５ｓ，６０℃ １ｍｉｎ９５℃ １５ｓ，ＰＣＲ引物设计如下。ＣＹＧＢ基因，引物为５＇－ＣＣＴＧＧＴＧＡＧ－ＧＴＴＣＴＴＴＧＴＧＡＡＣ－３＇（上游），５＇－ＣＡＧＡＡＴＧＡＣ－ＣＣＣＡＧＡＧＡＧＡＡＴＣ－３＇（下 游）。β－ａｃｔｉｎ（内 参）基因，引物为５＇－ＡＣＣＣＴＧＡＡＧＴＡＣＣＣＣＡＴＴＧ－３＇（上游），５＇－ＴＡＣＧＡＣＣＡＧＡＧＧＣＡＴＡＣＡＧ－３＇（下游）。
１．２．５免疫印迹试验加５０μＬ／孔单去污剂裂解液（含ＰＭＳＦ１００∶１）于六孔板内，超声波震荡，置冰上裂解３０ ｍｉｎ后，移至１．５ ｍＬ离心管中，４℃下１２０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，取上清并分装于０．５ｍＬ离心管中，保存于－２０℃冰箱中备用。总蛋白质抽提上样，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分离后电转移至ＰＶＤＦ膜上，用１０％脱脂牛奶封闭液室温封闭２ｈ后，加入鼠抗人的ＣＹＧＢ多克隆抗体（１∶２００）和β－ａｃｔｉｎ（１∶１０００），４℃孵育过夜，ＴＢＳＴ洗膜１０ｍｉｎ×３次，后加入辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠二抗（１∶１００００），水平摇床中晃动，室温孵育２ｈ，ＴＢＳＴ洗膜５ｍｉｎ×４次，暗室曝光。用ＱｕａｎｔｉｔｙＯｎｅ图像分析系统对分析系统对Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ结果进行分析。
１．２．６细胞活力实验每个缺氧组设置三个复孔神经元，缺氧前吸静培养基，ＰＢＳ洗净后每个孔加ＣＣＫ８试剂１００μＬ，培养２．５ｈ，酶标仪测量ＯＤ１值。
缺氧后再吸静培养基，ＰＢＳ洗净后每个孔加ＣＣＫ８试剂１００μＬ，培养２．５ｈ，酶标仪测量ＯＤ２值。算出各组的相对ＯＤ值：ＯＤ＝ＯＤ２／ＯＤ１，分别用８ｈ、１６ｈ、２４ｈ与０ｈ组比较计算出缺氧后各组细胞的生存率。
１．３统计学方法所有数据以ｘ－±ｓ表示，多组计量资料采用单因素方差分析，两两比较采用ＬＳＤ检验。Ｐ＜０．０５为差异有统计学意义。
２结果
２．１神经元纯度鉴定及细胞缺氧ＳＤ大鼠大脑皮层神经元培养及鉴定 培养６ｄ的海马神经细胞生长状态良好，胞体饱满，多呈梭形、锥形，少数呈多边形，胞浆丰富，核大，核仁隐约可见，突起联结成网，神经元特异性烯醇化酶（ＮＳＥ）免疫组织化学方法纯度鉴定结果显示神经元纯度大于９９％。见图１。细胞缺氧后，测氧仪监测的氧浓度波动于０．５％ ～０．９％之间。２．２荧光定量ＰＣＲ 相对于正常组，缺氧组ＣＹＧ－ＢｍＲＮＡ随着缺氧时间逐渐升高：８ｈ，１６ｈ，２４ｈ分别是０ｈ组的（１．２２±０．２１）倍，（１．４７±０．２８）倍，（１．７４±０．３９）倍，且每组（ｎ＝１２）之间差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５）。见图２。各组比值见表１。２．３免疫印迹试验 相对于正常组，缺氧组ＣＹＧＢ随着缺氧时间逐渐升高：８ｈ，１６ｈ，２４ｈ分别是０ｈ组的（１．５４±０．２１）倍，（２．１８±０．２８）倍，（３．０３±０．４）倍，且每组（ｎ＝４）之间差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５）。见表２、图３。２．４细胞活力实验结果 随着缺氧时间延长，生存率降低：８ｈ，１６ｈ，２４ｈ分别是０ｈ组的（０．９８±０．０１）倍，（０．９６±０．０１）倍，（０．９５±０．０１）倍，且每组（ｎ＝１２）之间差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５）。见图３，见表３。
３讨论
本实验神经元纯度达到９９％以上，氧浓度在０．５％～０．９％，确保了试验的准确性。细胞活力试验结果显示缺氧后神经元并没有大量死亡（损伤最严重２４ｈ组仍有９５％存活率），这或许和老鼠神经元长期处于一种低氧压的环境有关。众所周知，活细胞是产生核酸和蛋白的基础，因此缺氧后神经元的高存活率保证了有足够的神经细胞产生ＣＹＧ－ＢｍＲＮＡ和蛋白，从而能真实反映ＣＹＧＢ在神经细胞缺氧时如何表达。本实验荧光定量ＰＣＲ及Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ结果首次证实了低氧使神经细胞在核酸水平和蛋白水平都过表达ＣＹＧＢ。这与前人在其他组织及细胞上做的实验结果相符，ＥＦｏｒｄｅｌ等证实了在缺氧的心、肝、肌肉、脑中，ＣＹＧＢ含量升高。在体外缺氧实验中，多种癌细胞包括神经肿瘤细胞株ＨＮ３３、支气管上皮癌细胞株ＢＥＡＳ－２ｂ、宫颈癌细胞株ＨｅＬａ、多形胶质细胞瘤细胞株中的ＣＹＧＢ含量均增高。增高的程度与缺氧的时间和严重程度成正比。有趣的是，在本试验中，相对于正常组，核酸的升高倍数与蛋白的升高倍数并不平行，蛋白每个时间点的升高倍数都略高于核酸组，这或许与翻译过程和翻译后的加工、修饰有关。细胞红蛋白（ＣＹＧＢ）是在高等脊椎动物上发现的第四种珠蛋白，它广泛分布于人体各个组织器官。有学者推测它同样具有储氧和运输氧的功能。
ＤＨａｍｄａｎｅ等推测缺氧环境下Ｈ＋、ＮＡＤＨ等还原性物质的存在使ＣＹＧＢ产生变构而易于释放氧，从而使其可以有效的行使储氧及运输氧的功能。有研究证实了ＣＹＧＢ具有过氧化物酶和超氧化物歧化酶的作用，它可以利用亚铁原卟啉和硫醇残基清除活性氧 （ＲＯＳ）。人 为 的 使ＣＹＧＢ过表达能在氧化应激是保护细胞，清除活性氧（ＲＯＳ），脂源性活性物质，降低ＤＮＡ的损伤，提高细胞的生存率。敲除ＣＹＧＢ则会使ＲＯＳ清除速度减慢，细胞凋亡率增高。围生期缺氧缺血性脑病（ＨＩＥ）一直是新生儿致畸和致残的重要原因，足月新生儿的发病率约为２～４／１０００，早产儿的发病率更高。脑损伤是不可逆的疾病，有着大脑性麻痹，精神发育迟缓，学习障碍，癫痫等多种严重的后遗症。缺氧使脑细胞线粒体功能失调，能量代谢障碍。随之而来的是氧自由基、ＲＯＳ、脂质过氧化物的产生从而导致胞内蛋白，ＤＮＡ的损伤，细胞的坏死，凋亡。因此，及时的清除氧自由基，脂质过氧化物酶可以更好的保护脑细胞。近十年来，尽管人们做了大量的研究，但是还没有一套对ＨＩＥ行之有效的治疗方法，开发一些新的治疗方法势在必行。
ＣＹＧＢ的功能和它在脑内的广泛分布使它成为了治疗缺氧缺血性脑病ＨＩＥ的候选者之一。在缺氧应激的情况下，人为的增加ＣＹＧＢ表达和敲除ＣＹＧＢ分别能提高细胞的生存率和降低细胞的死亡率以及减少和增加脑组织的死亡面积。但是，之前的试验之前的实验虽有证实了ＣＹＧＢ与大脑缺氧之间的关系，但是大脑中细胞种类繁多，并不能直接说明在缺氧情况下ＣＹＧＢ与神经元的直接关系。然而临床上治疗ＨＩＥ时，我们最关心的正是神经元的存亡，这和病人的预后有很大的关联。本试验表明神经元在缺氧时确实会上调ＣＹＧＢ，结合证实的ＣＹＧＢ在缺氧时对细胞的保护作用和缺氧后绝大部分神经细胞存活，我们推测ＣＹＧＢ在缺氧应激可以通过清除自由基，脂源性活性物质等作用中保护神经细胞，增强神经元对缺氧的耐受能力，提高神经细胞缺氧时的生存率。因此，ＣＹＧＢ或许可能成为治疗ＨＩＥ的新途径。
然而，ＣＹＧＢ与缺氧应激的关系及它的功能尚存在着一些争议。ＤＬｉ等将神经母细胞瘤细胞株Ｎ２ａ置于５％（３８．５ｍｍＨｇ）的氧中，并未 发 现ＣＹＧＢ升高。这或许和实验设计的氧压过高有关，正常情况下哺乳类动物大脑皮层的平均氧压（３４．１＋５．６）ｍｍＨｇ，而神经母细胞瘤是神经细胞来源的。因此，５％的氧对于Ｎ２ａ细胞株可能并不算“缺氧”刺激。有学者结扎大脑中动脉后发现梗死区的ＣＹＧＢ并未增高。但是他们在检测ＣＹＧＢ时，梗死区域细胞已经完全坏死，而且检测是在２４ｈ之后，并不能排除在细胞未完全坏死时的２４ｈ之 内ＣＹＧＢ已经开始升高。
ＨＩＥ早期细胞未完全坏死，因此ＺｉｎｄｙＲａｉｄａ的结论并不能说明ＣＹＧＢ的表达与ＨＩＥ无关。综上所述，神经细胞在缺氧时将会上调ＣＹＧＢ，这种ＣＹＧＢ的上调或许是神经细胞的一种自我保护机制，因此，ＣＹＧＢ可能成为改善ＨＩＥ预后的潜在途径之一。当然，这还有很长的一段路要走。首先，本实验并未在神经细胞内敲除和过表达ＣＹＧＢ来测试它是否真的具有保护作用。其次，本实验并未探讨它的上下游基因，并不了解它的作用机制。将来的实验需要进一步验证这些问题。
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