激活素Ａ（ＡｃｔｉｖｉｎＡ，ＡｃｔＡ）是转化生长因子β（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ－β，ＴＧＦ－β）超家族成员之一，其作为ＡｃｔＡ／Ｓｍａｄｓ信号通路的第一信使，通过触发下游细胞内Ｓｍａｄｓ级联反应，完成具有一定生物学功能的信号转导过程。前期研究发现ＡｃｔＡ／Ｓｍａｄｓ通路具有抗缺血损伤的神经保护作用。但其相关信号转导及调节机制尚需进一步研究，本研究以该通路中重要的细胞内调节因子Ｓｍａｄ７为靶点，利用ＲＮＡ干扰技术抑制Ｓｍａｄ７基因表达，检测其对ＰＣ１２细胞ＯＧＤ损伤及ＡｃｔＡ／Ｓｍａｄｓ通路活化水平的影响，探讨Ｓｍａｄ７对ＡｃｔＡ／Ｓｍａｄｓ通路的调控机制。
１材料和方法
１．１主要材料
大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤ＰＣ１２细胞系购自中国医学科学院肿瘤细胞库。兔抗大鼠ＡｃｔＡ、Ｓｍａｄ７、β－ａｃｔｉｎ抗体购自Ｓａｎｔａ公司，羊抗兔二抗购自鼎国公司，鼠神经生长因子（ＮＧＦ）购自Ｓｉｇｍａ公司，Ｔｒ－ｉｚｏｌ总ＲＮＡ提取试剂盒购自上海生工公司，Ｑｕａｎｔ－ｓｃｒｉｐｔｃＤＮＡ合成试剂盒、ＲｅａｌＭａｓｔｅｒＭｉｘ（ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ）试剂盒购自天根公司。Ｓｍａｄ７和内参ＧＡＰ－ＤＨ基因引物委托上海生工合成。
１．２实验方法
１．２．１ＰＣ１２细胞培养及神经元转化含１０％马血清及１５％胎牛血清的高糖ＤＭＥＭ培养基常规培养ＰＣ１２细胞，２－３天换液后，当细胞接近８０％融合时，胰酶消化传代。细胞贴壁后加入终浓度为５０ｎｇ／ｍｌ的ＮＧＦ，连续刺激７天以诱导细胞神经元样转化。
１．２．２氧糖剥夺模型的建立 神经元样ＰＣ１２细胞经含有１０％胎牛血清和１．０ｍｏｌ／ＬＮａ２Ｓ２Ｏ４的无糖ＤＭＥＭ培 养 液 培 养１６ｈ，建 立ＯＧＤ１６ｈ组。
１．２．３大鼠Ｓｍａｄ７基因的ｓｉＲＮＡ合成设计大鼠Ｓｍａｄ７基因的ｓｉＲＮＡ，正义 链５’－ａａｃｇａｕｃｕｇｃｇｃｕｃｇｕｃｃｇｇｃｇｕｄｔｄｔ－３’； 反 义 链３’－ｄｔｄｔｕｕｇｃ－ｕａｇａｃｇｃｇａｇｃａｇｇｃｃｇｃａ－５’。ＳｉＲＮＡ及阴性对照基因序列委托吉凯生物有限公司合成。
１．２．４ｓｉＲＮＡ转染及分组２４孔板内细胞８０％融合时行转染，于前一天将培养液更换为不含血清及抗生素的高糖ＤＭＥＭ，分别转染靶向Ｓｍａｄ７基因的ｓｉＲＮＡ，阴性ｓｉＲＮＡ及对照ＰＢＳ，建立阳性转染组，阴性转染组及空转染组，转染浓度５０ｎＭ，２４ｈ后行ＯＧＤ１６ｈ。
１．２．５Ｓｍａｄ７基因ｍＲＮＡ的表达检测收集细胞，Ｔｒｉｚｏｌ法提取总ＲＮＡ，逆转录为ｃＤＮＡ。应用ＡＢＩ７５００Ｆａｓｔ型实时荧光定量ＰＣＲ仪对Ｓｍａｄ７基因及内参ＧＡＰＤＨｍＲＮＡ的表达进行检测。引物序 列 如 下：Ｓｍａｄ７上 游５＇－ＴＣＣＴＧＣＴＧＴＧ－ＣＡＡＡＧＴＧＴＴＣ－３＇，下 游５＇－ＡＧＴＡＡＧＧＡＧ－ＧＡＧＧＧＧＧＡＧＡＣ－３＇，片 段大小：１０４ｂｐ；ＧＡＰＤＨ上游５＇－ＧＧＴＴＡＣＣＡＧＧＧＣＴＧＣＣＴＴＣＴ－３＇，下游５＇－ＡＴＧＧＧＴＴＴＣＣＣＧＴＴＧＡＴＧＡＣ－３＇，片 段 大 小：１７１ｂｐ。结果应用ＲｅｌａｔｉｖｅＱｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ｄｄＣｔ）Ｓｔｕｄｙ软件行相对定量分析。检测实验重复三次。
１．２．６ＭＴＴ细胞存活率检测
三组细胞以１×１０４个／孔接种于９６孔板，每组１０个复孔，各组随机选择５个复孔行ＯＧＤ１６ｈ，每孔加人２０μｌ的ＭＴＴ（５ｍｇ／ｍｌ）３７℃孵育４ｈ后弃去培养液，加入２００μｌ的二甲基亚砜溶解蓝紫色结晶，充分振荡溶解，应用酶标仪在４９０ｎｍ激发波长测吸光度（Ａ）。ＯＧＤ１６ｈ的Ａ值与ＯＧＤ０ｈ的Ａ值比较，计算每组细胞存活率。检测实验重复三次。
１．２．７Ｓｍａｄ７和ＡｃｔＡ的蛋白水平检测
神经元样ＰＣ１２细胞，经ＯＧＤ１６ｈ处理的阳性及阴性转染组细胞分别消化离心，利用含有１％ ＰＭＳＦ的ＲＩ－ＰＡ裂解提取总蛋白，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳，转膜，封闭，而后分别用兔抗大鼠Ｓｍａｄ７（１∶５００）和ＡｃｔＡ（１∶５００）一抗４℃过夜孵育，洗膜，羊抗兔二抗（１∶５００）３７℃孵育２ｈ，ＥＣＬ显影压胶片。
１．３统计学分析
应用ＳＰＳＳ１０．０软件包，计量资料用ｘ珚±ｓ描述，均数间比较采用独立样本ｔ检验，多个均数比较采用单因素方差分析，Ｐ＜０．０５视为有统计学意义。
２结果
２．１Ｓｍａｄ７ｓｉＲＮＡ沉默效果检测
应用ＲｅａｌＴｉｍｅＲＴ－ＰＣＲ检测Ｓｍａｄ７ｍＲＮＡ的表达变化，阳性转染组Ｓｍａｄ７ｍＲＮＡ表达水平（０．３２±０．１３）较阴性转染组显着下调（０．６８±０．１４）（见图１）。２．２Ｓｍａｄ７及ＡｃｔＡ蛋白水平的表达检测
ｓｉＲＮＡ转染２４ｈ，Ｓｍａｄ７及ＡｃｔＡ蛋白表达检测显示：ＯＧＤ１６ｈ，ｓｉＲＮＡ阳性转染组Ｓｍａｄ７蛋白表达（０．３５±０．０８）与阴性组（１．１７±０．１２）比较，显着下调。ＯＧＤ后ＡｃｔＡ蛋白表达上调，以阳性转染组 为 着 （对 照 组：０．９４±０．１０，阴 性 转 染 组＋ＯＧＤ１６ｈ：１．２９±０．１３，阳性转染组＋ＯＧＤ１６ｈ：２．４６±０．１６）（见图２）。２．３细胞存活率ＭＴＴ检测
ＯＧＤ１６ｈ后ＭＴＴ细胞存活率检测结果显示：阳性转染组（９０．６８％±１．３１％）与阴性转染组（８０．５６％±２．１３％）及空转染组相比（７８．３％±１．７２％），存活细胞比例显着升高（见图３）。
３讨论
国内外研究及本课题组的前期工作均证实ＡｃｔＡ的抗缺血损伤神经保护作用。目前研究表明，其信号转导机制主要为Ｓｍａｄｓ家族蛋白将胞外信号传递至胞内继而调控核内基因的表达。在该通路信号转导过程中，Ｓｍａｄｓ蛋白作为重要结点，一方面，膜受体激活的Ｓｍａｄｓ２／３和通用Ｓｍａｄｓ（ｃｏｍｍｏｎｍｅｄｉａｔｏｒＳｍａｄｓ，Ｃｏ－Ｓｍａｄｓ）作为信号转导通路的细胞内传递因子发挥着级联反应功能，另一方面通过抑制性Ｓｍａｄｓ（Ｓｍａｄ６／７），抑制该通路的激活 过程。在非神经细胞模型的研究中，Ｓｍａｄ７主要通过与抑制性Ｓｍａｄｓ竞争结合ＴＧＦ－βＩ型受体以及促进ＴＧＦ－βＩ型受体去磷酸化而发挥负性调节作用。但Ｓｍａｄ７基因对神经细胞缺血性损伤及其相关的ＡｃｔＡ／Ｓｍａｄｓ通路活化的影响目前尚不明确。为此，本研究利用ＲＮＡ干扰技术，体外设计合成靶向大鼠Ｓｍａｄ７基因的ｓｉＲＮＡ，通过脂质体转染技术，瞬时转染神经元样ＰＣ１２细胞，继而对Ｓｍａｄ７在转录及蛋白水平的表达、细胞对ＯＧＤ损伤的敏感性及ＡｃｔＡ／Ｓｍａｄｓ通路的活化水平进行研究。
结果发现，ＰＣ１２细胞经外源性ｓｉＲＮＡ瞬时转染后，经实时定量ＰＣＲ及蛋白印记检测均证实细胞内Ｓｍａｄ７基因在ｍＲＮＡ及蛋白水平的表达均明显下调，细胞ＯＧＤ损伤后的存活率升高，与阴性转染组及空转染组相比有显着差异。
本研究进一步对ＡｃｔＡ蛋白的表达情况进行了检测，以明确ＡｃｔＡ／Ｓｍａｄｓ通路的活化水平，结果显示ＯＧＤ损伤刺激激活了调细胞内初级ＡｃｔＡ蛋白合成，且此过程受Ｓｍａｄ７基因的负向调节。考虑到细胞外ＡｃｔＡ是该信号通路的始动因素，目前研究结果提示了ＡｃｔＡ／Ｓｍａｄｓ通路活化可能存在着一定程度的环路（反馈）调节，在ＯＧＤ损伤过程中通过正反馈促进ＡｃｔＡ基因表达，维持通路活性，但该机制又受到Ｓｍａｄ７基因的负性调控，其途径一方面可能是通过经典机制下调通路活化程度，另一方面可能也与Ｓｍａｄ７可以结合核内ＤＮＡ，干扰可发挥生物 学 功 能 性 的Ｓｍａｄｓ－ＤＮＡ复合物形成有关。但Ｓｍａｄ７对ＡｃｔＡ／Ｓｍａｄｓ通路调控的确切机制仍有待于在时间水平上对神经细胞缺血损伤这一动态过程中不同时间位点以及空间水平上在细胞核内的进一步探讨和研究。
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